Reticulocitos

Objetivo

Que el alumno aprenda a identificar y cuantificar correctamente a los reticulocitos.

Introducción

Los reticulocitos son eritrocitos jóvenes y contienen en su interior RNA-ribosomal el cual puede observarse en forma de red (de ahí su nombre) mediante un colorante supravital.

Cuando en la médula ósea aumenta la eritropoyesis, aumenta también el nñumero de reticulocitos que salen hacia la circulación.

Material, reactivos y equipo

• Sangre venosa con EDTA
• Colorante de azul de cresil brillante o nuevo azul de metileno
• Tubos de ensaye
• Portaobjetos
• Pipetas pasteur allo corto con bulbo
• Baño maria
• Microscopio
• Aceite de inmersión

Procedimiento

1.- Mezclar la muestra sanguínea y en un tubo de ensaye colocar 5 gotas con una pipeta pasteur.

2.- Agregarle 5 gotas del colorante con una pipeta pasteur y mezclar.

3.- Incubar el tubo de ensaye a 37 C durante 15 minutos en el baño maria.

4.- Mezclar la suspensión y realizar un frotis en portaobjetos.

5.- Dejarlo secar a temperatura ambiente, agregarle una gota de aceite de inmersión y observar con el  objetivo 100X.

6.- Buscar células que presenten una red con coloración azul (reticulocitos). Contar 1000 eritrocitos en diferentes partes del frotis e ir registrando el número de reticulocitos observados.

Resultados

Número de reticulocitos observados x 100

___________________________________

Número total de eritrocitos

Valor de referencia

Adultos: 0.5 - 2.0 %

Recién nacidos: 2.5 - 6.5 %

Muestra 1: 1.3%

ÍNDICES ERITROCITARIOS (VALORES ABSOLUTOS)

(Valor Hto %)(10)                        
_______________  = V.C.C en M3
No. de eritrocitos / l    VALORES NORMALES
                                      82-92 M3

Sustitución

(46%)(10)        460
_________ = ______ = 88.8 M3 (valor normal)
5,180,000       5.18 / l

  

(Hb en gr/dl)(10)
_____________ = H.C.M. en pg
No. eritrocitos/l      VALORES NORMALES
                                 28-32 pg
Sustitución

(15.28)(10)
_________ = 29.49 pg (valor normal)
5.18 / l


  

  

(Hb en gr/dl)(10)
_____________ = C.H.C.M. en %
Valor Hto %           VALORES NORMALES
                                32-36%
Sustitución

(15.28)(10)
_________ = 33.21 % (valor normal)
     46%

Hematocrito

INTRODUCCIÓN

El hematocrito es el volúmen que ocupan los eritrocitos en una muestra sanguínea y se expresa en porcentaje.

La determinación de hematocrito es un método sencillo y confiable para detectar anemia o policitemia.

El hematocrito se puede determinar por 2 métodos:

1.- MACROMÉTODO (WINTROBE)

2.- MICROMÉTODO

MATERIAL Y REACTIVOS

• Tubo de Wintrobe                                    - Sangre venosa
• Tubo capilar
• Plastilina
• Centrifuga
• Microcentrifuga
• Pipeta Pasteur tallo largo
• Equipo para venopunción
• Lector para hematocrito o regla

TÉCNICA (MACROMÉTODO)

1. Mezclar la muestra sanguínea suavemente y con una pipeta pasteur o canula llenar el tubo de wintrobe, colocando la punta de la pipeta hasta el fondo del tubo, la punta de la pipeta se va elevando pero permaneciendo por debajo del menisco de sangre para evitar la formación de burbujas o espuma.                                                                                 
2. El tubo se llena hasta la marca 100 con la muestra sanguínea y se pone a centrifugar durante 30 minutos a 3000 rpm.                                                               
3. Se efectúa la lectura.

TÉCNICA (MICROMÉTODO)

1.- Mezclar la muestra sanguínea adecuadamente y llenar un tubo capilar hasta 3/4 partes. 

2.- El extremo vacío que no estuvo en contacto con la sangre se sella con plastilina o calor. 

3.- El tubo con la muestra sanguínea se coloca en la microcentrifuga a 10,000 rpm. durante 10 minutos.

4.- Leer el porcentaje de hematocrito en el lector o medirlo con una regla. 

VALORES NORMALES

Hombres: 42% - 52%

Mueres: 37% - 47%

RESULTADOS

Muestra 1: 

Macrométodo: 65%

Micrométodo: 47%

Muestra 2:

Macrométodo: 44%

Micrométodo: 43%

Determinación de hemoglobina

Objetivo:

Determinar cuantos gr de hemoglobina (Hb) hay en toda la sangre circulante.

                                                                   Fundamento

La hemoglobina es una proteína conjugada que sirve para el transporte de oxígeno y dióxido de carbono. La masa total de eritrocitos de un adulto contiene unos 600gr. De hemoglobina capaces de transportar 800ml de oxígeno.Una molécula de hemoglobina consta de 2 pares de cadenas polipepticas (unión de aminoácidos) (globina) y 4 grupos proteicos HEM que contienen cada uno un átomo de fe en estado ferroso. Cada punto HEM se localiza en una zona determinada de una de las cadenas de polipepticos. Localizando cerca la superficie de la molécula, el HEM se combina de forma reversible con una molécula de oxigeno y dióxido de carbono. Este grupo HEM es el responsable del del color rojo de la hemoglobina (hb).La parte proteica o globina tiene 4 cadenas polipeptidicas que se denominan con las letras α, β, γ, δ. Existe una cadena mas la ε que esta presente durante los 3 primeros meses de vida se diferencian unas de las otras en el numero o posición (de los aminoácidos de los que están compuestas). Por lo tanto existen varios tipos de hb. en el ser humano se pueden encontrar las siguientes hemoglobinas normales:Hemoglobina A: consat de 2 cadenas α y 2 cadenas β en un adulto normal corresponde a mas del 95% del total.Hemoglobina A´: consat de 2 cadenas α y 2 cadenas δ en un adulto sano esta en porción menor de 3%.Hemoglobina F (fetal): consa de 2 cadenas α y 2 cadenas γ. Es la hemoglobina principal en el feto desde el 4° mes del embarazo hasta aproximadamente los 6 meses de edad. La Hb F tiene mayor afinaidad por el oxigeno.Hemoglobina Gower: consa de 2 cadenas α y 2 cadenas ε. Desaparece casi por completo en el tercer mes de embarazo y empieza a aparecer la Hb fetal.Algunos datos se obtiene exmainando a simple vista una muestra de sangre. Un aspecto normal del suero o del plasma revela que el pigmento esta en los glóbulos rojos. Si se agita en una sangre total normal en el aire durante 15 min. Adquere un color rojo claro por convertir la Hb en oxihemoglobina.La sangre tiene un color rojo cereza brillante cuando el pigmento es carboxi-hemoglobina en la intoxicación por CO. El color es chocolate en la metahemoglobulemia y la banda malvada en alsulfohemoglobulemia.Las distintas Hb tienen espectros de absorción características a las que determina en un espectofotometro. La identificación de difrenetes formas de la Hbcon la determinación de sus espectros de absorción puede hacerse de una manera sencilla.

                                                          Material y Equipo:

·        Espectrofotómetro.
·          Pipeta de vidrio graduada de 5 mL
·         Pipeta semiautomatizada
·          Tubos de ensaye
·         Cubetas
·         Gradilla

                                                                 Reactivos:

·         EDTA
·         Reactivo Drabkin
·         Ferrocianuro de potasio
·         Cianuro de potasio
·         Bicarbonato de potasio
·         Solución estándar de cianometahemoglobina

                                                            Reactivos biológicos:

·         Sangre venosa con EDTA.

                                                                       Técnica:

1.-En un tubo de 13 x 100 colocar exactamente 5 mL de reactivo de Drabkin, marcarlo como problema (P).

2.-Obtener 5 ml de sangre venosa con anticoagulante (EDTA).

3.- Mezclar perfectamente la sangre problema, por inversión por lo menos 20 veces antes de tomar la muestra.

4.-Con una pipeta automática o pipeta de Shali se toma exactamente 0,02 mL (20 µL) de sangre total, limpiar luego la punta de la pipeta.

5.-La sangre tomada del tubo con EDTA se vierte en el tubo que contenga reactivo de Drabkin. Se enjuaga 3 veces y se mezcla.

6.  Mezcle la solución de Drabkin con la sangre por inversión y con mucha precaución (utiliza parafilm para tapar los tubos, recuerda que el reactivo tiene cianuro, el cual es un VENENO).

7.-Dejar en reposo por espacio de 3 a 5 minutos. Para que se  efectúe la reacción.

8.-Después de ese tiempo se observara una coloración roja transparente, se llena las cubetas hasta la marca que se encuentra y se procede la lectura.

9.-Leer en absorbancia con filtro verde a 540 nm llevando a cero el fotómetro con agua destilada / Drabkin.

PARA HACER LA MEDICION DE TRANSMITANCIA HACER EL SIGUIENTE PROCEDIMIENTO:

Medición de Transmitancia:

1.- Encender el Espectrofotómetro 30 minutos antes, después  seleccione la longitud de onda deseada (540 nm para Hb) con las teclas numéricas y oprima <GO TO>.  Aparecerá en la pantalla el valor numérico.

2.-Presione < %T> para Transmitancia. Aparecerá en la pantalla “T”.

3.-Inserte la cubeta con el blanco en el portacubeta, cierre la puerta y oprima <SECOND FUNCTION> Y <100 %>. Aparecerá En la pantalla 100.0 T.

4.-Remueva el blanco e inserte la muestra problema contenida en la celda y cierre la puerta. Aparecerá en la pantalla el valor en Transmitancia.

.-

5.-Retire la cubeta del compartimiento y cierre la puerta (lave la cubeta y  guárdela).

                                                                    Cálculos:

Hb total = concentración de Hb (gr/ml) x volumen sanguíneo (ml).

En espectofotometro se aplica la siguiente formula:

muestra/ estandar x 15 = Hb                                                        

Valores de referencia:

Mujeres……………………………………... 12 - 16 g/dL

Hombres……………………………………. 14 - 18 g/dL

Resultado

 Paciente: Rosa Guadalupe Zúñiga Gómez: 14 g/dl

Técnicas macroscópicas coproparasitoscópicas "Tamizado"

Se fundamenta en el fenómeno de la filtración, utilizando tamices de diferentes diámetros en donde quedan atrapados los parásitos (trematodos, cestodos, nematodos). Esta técnica permite observar directamente las características morfológicas de los parásitos adultos, enteros o fraccionados de los metazoarios.

Material y equipo

• Coladera de tamiz fino
• Abatelenguas
• Caja petri
• Pinzas

Procedimiento

1. Colocar pequeñas porciones de materia fecal en la coladera con ayuda del abatelenguas.

2. Dispersar la muestra con el abatelenguas y agregarle agua hasta lograr un tamizado lo mas limpio posible.

3. Revisar cuidadosamente las partículas de las heces que hayan quedado en la coladera.

4. Los parásitos encontrados colocarlos en una caja petri con solución salina.

5. Se identifica la parte del parásito o el parásito completo.

6. Se reporta el género y especie del parásito o parte del parásito.

MÉTODO DE CONCENTRACIÓN POR FLOTACIÓN DE WILLIS

Introducción

Éste método está recomendado especialmente para la investigación de protozoarios y helmintos. Consiste en preparar la materia fecal con solución saturada de cloruro de sodio.
Los huevos y quistes de peso específico menor que la solución saturada de cloruro de sodio tienden a subir y adherirse a un cubreobjetos colocado en contacto con la superficie del líquido.

Material y reactivos

• Vaso de precipitado
• Embudo
• Gasa
• Tubo de ensaye 
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Solución saturada de NaCl
• Solución de Yodo-Lugol

Procedimiento

1. Tomar aproximadamente 1 gr. de heces fecales con el abatelenguas.
2. Colocar la mezcla en un vaso de precipitados y mezclar con 10 ml de solución saturada de cloruro de sodio.
3. En un tubo de ensaye filtre la mezcla con una gasa, llenando completamente el tubo.
4. Coloque un cubreobjetos sobre el tubo, de manera que el líquido haga contacto con el cubreobjetos.
5. Esperar de 5 a 10 minutos.
6. Los quistes o huevos flotarán y quedarán adheridos a la cara del cubreobjetos que está en contacto con la muestra.
7. Colocar una gota de Yodo-Lugol sobre un portaobjetos, retirar el cubreobjetos con cuidado para evitar pérdida del material y ponerlo sobre el portaobjetos.
8. Examinar la muestra al microscopio con el objetivo de 40X, buscando quistes o huevec.illos de parásitos.

Método de concentración por sedimentación RItchie

FUNDAMENTO: Se basa en la concentración de los quistes y huevos por sedimentación mediante la centrifugación, con la ayuda de formol y éter para separar y visualizar los elementos parasitarios.
Una de las ventajas que tiene este método es concentrar y no deformar las formas parasitarias, permite el transporte y almacenamiento de la materia fecal procesada antes de ser examinada, se usa cuando se necesita una técnica para evaluación de tratamiento y determinación de frecuencia.

MATERIAL Y EQUIPO:
- Centrífuga
- Tubos de ensayo cónicos de 15 ml.
- Gasa cortada en cuadros
- Embudos de polietileno
- Vasos de precipitado de 50 ml.
- Aplicadores de madera
- Pipetas Pasteur con bulbo
- Portaobjetos de 26 X 76 mm.
- Cubreobjetos de 22 X 22 mm.
- Microscopio
- Solución salina isotónica
- Solución de formaldehido al 10%
- Éter

MÉTODO: 
1. Con el aplicador de madera se coloca aproximadamente 1 gr. de la materia fecal en el vaso de
 precipitado, se añaden 10 ml. de solución salina y se homogeniza.
2. Se filtra la suspensión a través de la gasa colocada en el embudo, recogiendo el filtrado en el tubo cónico.
3. Se centrifuga la suspensión durante 2min a 2000 rpm.
4. Se decanta el sobrenadante y se resuspende el sedimento con solución salina, centrifugando, decantando y resuspendiendo 2 veces más.
5. Al último sedimento se agregan 10 ml de solución de formaldehido al 10%, se mezcla y se deja reposar durante 10 min.
6. Se añaden después 5 ml. de éter, se tapan los tubos con tapones de caucho y se agitan enérgicamente durante 30 segundos
7. Se centrifuga durante 2 min a 2000 rpm.
8. Después de centrifugar se observan 4 capas:
- éter en la superficial
- un tapón de restos fecales
- formaldehido
- sedimento en el fondo del tubo, conteniendo los elementos parasitarios
9. Se decanta el sobrenadante.
10. Se introduce la pipeta Pasteur hasta el sedimento, se extrae con cuidado una gota del sedimento y se coloca en un portaobjetos.
11. Se le añade una gota de lugol y con uno de los ángulos del cubreobjetos, se homogeniza, cubriéndolo con el mismo.
12. Se observa la preparación en el microscopio con objetivos de 10X y 40X.